Ігровий процес стандартний для серії Assassin's Creed, так як є розвитком ігрового процесу Assassin's Creed II. Як і в попередніх частинах, основою механіки гри є паркур, використання натовпу й різних укриттів для непомітних убивств («стелс») і розвиненої системи ближнього бою. Відкритий світ гри представляє деякою мірою ступінь нелінійності проходження, хоча основні сцени гри та їх хронологічні рамки збудовані за допомогою системи скриптів. Безпосереднє проходження сюжетної лінії займає близько 15 годин. Окрім того, гравцю знову надана можливість перегравати всі сюжетні місії гри. Події гри відбуваються переважно у Римі XVI століття, проте періодично вони переносяться в недалеке майбутнє, де головним героєм є Дезмонд Майлз (англ. Desmond Miles), який навчається мистецтву асасина за допомогою машини «Анімус 2.0» (лат. anima — душа), що дозволяє зчитувати генетичну інформацію пращурів Дезмонда і занурюватись у його минуле. Головний герой історичної частини гри — Еціо Аудиторе да Фіренце (італ. Ezio Auditore da Firenze), один з лідерів і наставників ордену Асасинів. Найлютіші вороги асасинів — представники впливового клану Борджіа, повністю контролюють політику Риму та його корумпованих лідерів. У порівнянні з попередньою грою, бойова система не зазнала серйозних змін. За словами розробників, динаміка бою стала більш активною і наступальною. Тепер заохочуються швидкі атаки, контратаки стали менш ефективними. Система дій NPC стала агресивною, тепер гравця можуть атакувати одразу кілька супротивників. Збільшилось число зброї, з'явилася можливість використовувати стаціонарні гармати у деяких ігрових ситуаціях. Окрім того, серйозно переглянута роль коня, на якому тепер можна пересуватися й у межах міста. Кінь також бере участь у деяких елементах паркуру. У процесі виконання завдань Еціо зустрічає та взаємодіє з різними історичними персонажами, такими як Леонардо да Вінчі, Нікколо Макіавеллі, Катерина Сфорца. Представники роду Борджіа є основними ворогами гри. Сюжет гри загалом чітко вписаний в хронологічні рамки.

Незважаючи на суперечливу першу частину, Assassin's Creed II в середньому отримала 91 % від критиків[6].