Название игры и её сюжет отсылают к известному библейскому сюжету с тем же названием: главный герой, ребёнок по имени Исаак, прячется в подвале дома от матери, которой «голос Бога» повелел убить сына. Управляя Исааком или другим из шести персонажей на выбор, игрок должен пройти через несколько уровней подвала, состоящих из множества процедурно генерируемых комнат и населенных враждебными существами. Внутри комнат игровой процесс оформлен в виде шутера — персонаж должен, «стреляя» собственными слезами, поразить врагов, одновременно избегая столкновений с ними. Смерть в The Binding of Isaac является необратимой — если персонаж потеряет все свое здоровье, игрок будет вынужден начать игру с самого начала. По словам Макмиллена, игра затрагивает такие темы, как жестокое отношение к детям, половая идентичность, детоубийство, пренебрежение, самоубийство, аборт, а также как религия может навредить ребёнку — темы, которых обычно стараются избегать.